A kígyóméreg olyan enzimeket tartalmaz, amelyek hidrolizálják a karboxil-észter kötéseket.A hidrolízis szubsztrátjai foszfolipidek, acetilkolin és aromás acetát.Ezeknek az enzimeknek három fajtája van: foszfolipáz, acetilkolinészteráz és aromás észteráz.A kígyóméregben található arginin-észteráz képes szintetikus arginint vagy lizint is hidrolizálni, de elsősorban a természetben lévő fehérje peptidkötéseket hidrolizálja, így a proteázokhoz tartozik.Az itt tárgyalt enzimek csak észter szubsztrátokra hatnak, és nem hatnak semmilyen peptidkötésre.Ezen enzimek közül az acetilkolinészteráz és a foszfolipáz biológiai funkciói fontosabbak, és ezeket alaposan tanulmányozták.Néhány kígyóméreg erős aromás észteráz aktivitással rendelkezik, amely képes hidrolizálni a p-nitro-fenil-etil-észtert, a- vagy P-naftalin-acetátot és az indol-etil-észtert.Még mindig nem ismert, hogy ezt az aktivitást egy független enzim vagy a karboxil-észteráz ismert mellékhatása okozza-e, nem beszélve annak biológiai jelentőségéről.Amikor az Agkistrodon halys Japonicus mérgét p-nitro-fenil-etil-észterrel és indol-etil-észterrel reagáltatták, a p-nitro-fenol és az indol-fenol hidrolizátumait nem találták meg;Ellenkezőleg, ha ezek az észterek reagálnak a kobra Zhoushan alfaj kígyómérgével és a Bungarus multicinctus kígyóméreggel, akkor gyorsan hidrolizálódnak.Ismeretes, hogy ezek a kobramérgek erős kolinészteráz aktivitással rendelkeznek, ami felelős lehet a fenti szubsztrátok hidrolíziséért.Valójában Mclean és mtsai.(1971) arról számoltak be, hogy számos, a Cobra családba tartozó kígyóméreg képes hidrolizálni az indol-etil-észtert, a naftalin-etil-észtert és a butil-naftalin-észtert.Ezek a kígyómérgek a következőkből származnak: kobra, fekete nyakú kobra, fekete ajakú kobra, aranykobra, egyiptomi kobra, királykobra, aranykobra mamba, fekete mamba és fehér ajkú mamba (D. aw még mindig ismeri a keleti rhombola csörgőkígyót
A kígyóméreg képes hidrolizálni a metil-indol-etil-észtert, amely a szubsztrát a szérum kolinészteráz aktivitásának meghatározásához, de ez a kígyóméreg nem mutat kolinészteráz aktivitást.Ez azt mutatja, hogy a kobraméregben ismeretlen észteráz található, amely különbözik a kolinészteráztól.Az enzim természetének megértéséhez további elválasztási munkára van szükség.
1, foszfolipáz A2
(I) Áttekintés
A foszfolipáz egy olyan enzim, amely képes hidrolizálni a gliceril-foszfátot.A természetben 5 féle foszfolipáz létezik, nevezetesen a foszfolipáz A2 és a foszfolipáz
A., foszfolipáz B, foszfolipáz C és foszfolipáz D. A kígyóméreg főként foszfolipáz A2-t (PLA2) tartalmaz, néhány kígyóméreg foszfolipáz B-t, más foszfolipázok pedig főleg állati szövetekben és baktériumokban találhatók meg.A 3-11-4. ábrán ezeknek a foszfolipázoknak a hatáspontja látható a szubsztrát hidrolízisére.
A foszfolipázok közül a PLA2-t többet tanulmányozták.Ez lehet a legtöbbet tanulmányozott enzim a kígyóméregben.Szubsztrátja az Sn-3-glicerofoszfát második pozíciójában lévő észterkötés.Ez az enzim széles körben megtalálható a kígyóméregben, a méhméregben, a skorpióméregben és az állati szövetekben, a PLA2 pedig négy kígyóméreg családjában található.Mivel ez az enzim lebontja a vörösvérsejteket és hemolízist okoz, „hemolizinnek” is nevezik.Vannak, akik a PLA2-t hemolitikus lecitináznak is nevezik.
Ludeeke először találta meg, hogy a kígyóméreg hemolitikus vegyületet tud előállítani azáltal, hogy enzimeken keresztül hat a lecitinre.Később Delezenne et al.bebizonyította, hogy amikor a kobraméreg a lószérumra vagy sárgájára hat, hemolitikus anyagot képez.Ma már ismert, hogy a PLA2 közvetlenül hathat az eritrocita membrán foszfolipidjeire, tönkretéve az eritrocita membrán szerkezetét és közvetlen hemolízist okoz;Hathat a szérumra vagy a hozzáadott lecitinre is, és hemolitikus lecitint termel, amely a vörösvértestekre hat, és közvetett hemolízist idéz elő.Bár a PLA2 bőséges a négy kígyóméreg családban, a különböző kígyómérgek enzimtartalma kissé eltér.Csörgőkígyó (C
A kígyóméreg csak gyenge PLA2 aktivitást mutatott.A 3-11-11. táblázat szemlélteti a mérges kígyók 10 fő mérge PLA2 aktivitásának összehasonlítását Kínában.
3-11-11 táblázat 10 kígyóméreg foszfolipáz VIII aktivitásának összehasonlítása Kínában
Kígyóméreg
Zsír felszabadulás
alifás sav,
Cjumol/mg)
Hemolitikus aktivitás CHU50/^ g * ml)
Kígyóméreg
Zsírsavak felszabadítása
(^raol/mg)
Hemolitikus aktivitás „(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
tizenegy
Micracephal ophis
ötpont egy nulla
kalyspallas
8. 68
kétezer-nyolcszáz
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
három pont nyolc kettő
száznegyven
Bnugarus fasctatus
7,56
kétszáznyolcvan
B. multicinctus
egy pont kilenc hat
kétszáznyolcvan
Vipera a russelli
hét pont nulla három
T, mucrosquamatus
egy pont nyolc öt
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Elválasztás és tisztítás
A kígyóméregben nagy a PLA2-tartalom, hőálló, sav, lúg és denaturáló hatású, így könnyen tisztítható és elkülöníthető a PLA2.Az elterjedt módszer az, hogy először gélszűrést végeznek a nyers méregen, majd ioncserélő kromatográfiát végeznek, és a következő lépés megismételhető.Megjegyzendő, hogy a PLA2 liofilizálása ioncserélő kromatográfia után nem okozhat aggregációt, mert a fagyasztva szárítás gyakran növeli a rendszer ionerősségét, ami a PLA2 aggregációját okozó fontos tényező.A fenti általános módszerek mellett a következő módszereket is alkalmazták: ① Wells et al.② A PLA2 szubsztrát analógját használtuk ligandumként az affinitáskromatográfiához.Ez a ligandum kígyóméregben Ca2+-mal képes kötődni a PLA2-hez.Az EDTA-t többnyire eluensként használják.A Ca2+ eltávolítása után a PLA2 és a ligandum közötti affinitás csökken, és a ligandumtól disszociálható.Mások 30%-os szerves oldatot vagy 6 mol/l karbamidot használnak eluensként.③ Hidrofób kromatográfiát végeztünk PheiiylSephar0SeCL-4B-vel, hogy eltávolítsuk a PLA2 nyomait a kardiotoxinban.④ Anti-PLA2 antitestet használtunk ligandumként a PLA2 affinitáskromatográfiájának elvégzéséhez.
Eddig nagyszámú kígyóméreg PLAZ került megtisztításra.Tu et al.(1977) felsorolja az 1975 előtt kígyóméregből tisztított PLA2-t. Az elmúlt években minden évben nagyszámú cikk jelent meg a PLA2 elválasztásáról és tisztításáról.Itt a PLA kínai tudósok általi szétválasztására és tisztítására összpontosítunk.
Chen Yuancong et al.(1981) három PLA2 fajt különített el a zhejiangi Agkistrodon halys Pallas méregéből, amelyek izoelektromos pontjaik alapján savas, semleges és lúgos PLA2-re oszthatók.Toxikussága szerint a semleges PLA2 mérgezőbb, amelyet preszinaptikus neurotoxinként, Agkistrodotoxinként azonosítottak.Az alkáli PLA2 kevésbé mérgező, a savas PLA2 pedig szinte semmilyen toxicitást nem mutat.Wu Xiangfu et al.(1984) három PLA2 jellemzőit hasonlították össze, beleértve a molekulatömeget, az aminosav-összetételt, az N-terminálist, az izoelektromos pontot, a hőstabilitást, az enzimaktivitást, a toxicitást és a hemolitikus aktivitást.Az eredmények azt mutatták, hogy hasonló molekulatömegűek és termikus stabilitásuk volt, de más szempontból jelentős különbségek mutatkoztak.Az enzimaktivitás szempontjából a savas enzimaktivitás magasabb volt, mint a lúgos enzimaktivitás;A lúgos enzim hemolitikus hatása a patkány vörösvértestekre volt a legerősebb, ezt követte a semleges enzim, a savas enzim pedig alig hemolizálódott.Ezért feltételezhető, hogy a PLAZ hemolitikus hatása összefügg a PLA2 molekula töltésével.Zhang Jingkang et al.(1981) Agkistrodotoxin kristályokat készítettek.Tu Guangliang et al.(1983) arról számolt be, hogy egy 7,6-os izoelektromos pontú toxikus PLA-t izoláltak és tisztítottak meg a fujiani Vipera rotundus mérgéből, fizikai és kémiai tulajdonságairól, aminosav-összetételéről és 22 aminosavból álló szekvenciájáról az N-nél. -terminál került meghatározásra.Li Yuesheng et al.(1985) egy másik PLA2-t izoláltak és tisztítottak a Viper rotundus mérgéből Fujianban.A PLA2* alegysége 13 800, izoelektromos pontja 10,4, fajlagos aktivitása 35/xnioI/miri mg. Lecitinnel mint szubsztráttal az enzim optimális pH-ja 8,0 és az optimális hőmérséklet 65 °C. LD5 intravénásan injektálva egerekbe.Ez 0,5 ± 0,12 mg/kg.Ennek az enzimnek nyilvánvaló véralvadásgátló és hemolitikus hatása van.A toxikus PLA2 molekula 18 féle aminosav 123 csoportjából áll.A molekula gazdag ciszteinben (14), aszparaginsavban (14) és glicinben (12), de csak egy metionint tartalmaz, N-terminálisa pedig szerinmaradék.A Tuguang által izolált PLA2-vel összehasonlítva a két izoenzim molekulatömege és aminosav-maradékainak száma nagyon hasonló, és az aminosav-összetétel is nagyon hasonló, de az aszparaginsav és a prolin csoportok száma némileg eltér.A Guangxi királykobra kígyóméreg gazdag PLA2-t tartalmaz.Shu Yuyan et al.(1989) PLA2-t izoláltak a méregből, amelynek fajlagos aktivitása 3,6-szor nagyobb, mint az eredeti méreg, molekulatömege 13 000, összetétele 122 aminosavból áll, izoelektromos pontja 8,9, és jó hőstabilitású.A bázikus PLA2 vörösvértestekre gyakorolt hatásának elektronmikroszkópos megfigyeléséből látható, hogy nyilvánvaló hatása van az emberi vörösvértest-membránra, de nincs nyilvánvaló hatása a kecske vörösvértesteire.Ez a PLA2 nyilvánvalóan késlelteti a vörösvértestek elektroforetikus sebességét emberben, kecskében, nyulakban és tengerimalacokban.Chen et al.Ez az enzim gátolni tudja az ADP, a kollagén és a nátrium-arachidonsav által kiváltott vérlemezke-aggregációt.Ha a PLA2-koncentráció 10/xg/ml~100g/ml, a vérlemezke-aggregáció teljesen gátolt.Ha mosott vérlemezkéket használtunk anyagként, a PLA2 nem tudta gátolni az aggregációt 20 Mg/ml koncentrációban.Az aszpirin a ciklooxigenáz inhibitora, amely gátolja a PLA2 vérlemezkékre gyakorolt hatását.A PLA2 gátolhatja a vérlemezkék aggregációját az arachidonsav hidrolizálásával, hogy a tromboxán A2 szintetizálódjon.A Zhejiang tartományban az Agkistrodon halys Pallas méreg által termelt PLA2 oldatkonformációját cirkuláris dikroizmus, fluoreszcencia és UV-abszorpció segítségével tanulmányozták.A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy ennek az enzimnek a fő lánc konformációja hasonló más fajokból és nemzetségekből származó azonos típusú enzimekéhez, a váz konformációja jó hőállóságú, és a savas környezetben bekövetkezett szerkezeti változás visszafordítható.A Ca2+ aktivátor és az enzim kombinációja nem befolyásolja a triptofánmaradékok környezetét, míg az inhibitor Zn2+ ennek ellenkezőjét.Az a mód, ahogyan az oldat pH-értéke befolyásolja az enzimaktivitást, eltér a fenti reagensektől.
A kígyóméreg PLA2-tisztításának folyamatában nyilvánvaló jelenség, hogy egy kígyóméreg két vagy több PLA2-elúciós csúcsot tartalmaz.Ez a jelenség a következőképpen magyarázható: ① izoenzimek létezése miatt;② A PLA2 egyik fajtáját különféle, különböző molekulatömegű PLA2-keverékekké polimerizálják, amelyek többsége a 9 000-40 000 közötti tartományba esik;③ A PLA2 és más kígyóméreg komponensek kombinációja bonyolítja a PLA2-t;④ Mivel a PLA2 amidkötése hidrolizálódik, a töltés megváltozik.① és ② gyakoriak, csak néhány kivétellel, mint például a PLA2 a CrWa/w kígyóméregben
Két helyzet van: ① és ②.A harmadik állapotot a PLA2-ben találták meg a következő kígyók mérgében: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palesztin vipera, homoki vipera és szörnyű csörgőkígyó km.
A ④ eset eredménye szerint a PLA2 migrációs sebessége megváltozik az elektroforézis során, de az aminosav összetétel nem változik.A peptidek hidrolízissel széttörhetők, de általában még mindig diszulfidkötések kötik össze őket.A keleti gödör csörgőkígyójának mérge a PLA2 két formáját tartalmazza, ezeket a típusú, illetve p típusú PLA2-nek nevezik.A PLA2 e két típusa között csak egy aminosav a különbség, vagyis az egyik PLA2 molekulában a glutamint a másik PLA2 molekulában glutaminsav helyettesíti.Bár ennek a különbségnek a pontos oka nem világos, általában úgy gondolják, hogy ez a PLA2 dezaminációjával kapcsolatos.Ha a palesztin viperaméregben lévő PLA2-t melegen tartják a nyers méreggel, az enzimmolekuláiban a végcsoportok több lesz, mint korábban.C-ből a kígyóméregből izolált PLA2-nek két különböző N-terminálisa van, molekulatömege 30000. Ezt a jelenséget a PLA2 aszimmetrikus dimerje okozhatja, amely hasonló a keleti gyémánthátú csörgőkígyó mérgében a PLA2 által alkotott szimmetrikus dimerhez. és nyugati gyémánthátú csörgőkígyó.Az ázsiai kobra számos alfajból áll, amelyek közül néhány nem túl határozott az osztályozásban.Például, amit korábban Cobra külső kaszpi alfajnak hívtak, ma már felismerték
A külső Kaszpi-tengeri kobrának kell tulajdonítani.Mivel sok alfaj létezik, és keverednek egymással, a kígyóméreg összetétele a különböző források miatt nagymértékben változik, és a PLA2 izoenzimek tartalma is magas.Például kobraméreg
Az r ^ ll fajok legalább 9 féle PLA2 izoenzimét találták, a Caspian kobra-alfaj mérgében pedig 7 féle PLA2 izoenzimet.Durkin et al.(1981) a PLA2-tartalmat és az izoenzimek számát tanulmányozták különböző kígyóméregekben, köztük 18 kobraméregben, 3 mambaméregben, 5 viperaméregben, 16 csörgőkígyóméregben és 3 tengeri kígyóméregben.Általában a kobraméreg PLA2 aktivitása magas, sok izoenzimmel.A viperaméreg PLA2 aktivitása és izoenzimjei közepesek.A mambaméreg és a csörgőkígyóméreg PLA2-aktivitása nagyon alacsony, vagy egyáltalán nincs PLA2-aktivitás.A tengeri kígyóméreg PLA2 aktivitása szintén alacsony.
Az elmúlt években nem számoltak be arról, hogy a kígyóméregben lévő PLA2 aktív dimer formájában létezne, mint például a keleti rhombophora csörgőkígyó (a C. kígyóméreg a és P típusú PLA2-t tartalmaz, mindkettő két azonos alegységből áll , és csak a dimeráz rendelkezik
Tevékenység.Shen és mtsai.azt is javasolta, hogy csak a kígyóméreg PLA2 dimerje az enzim aktív formája.A térszerkezet vizsgálata azt is bizonyítja, hogy a nyugati gyémánthátú csörgőkígyó PLA2-je dimer formájában létezik.Halevő vegyület
A kígyóméregnek két különböző PLA^Ei és E2-je van, amelyekben a 仏 dimer formájában létezik, a dimer aktív, a disszociált monomerje pedig inaktív.Lu Yinghua et al.(1980) tovább tanulmányozták E. Jayanthi és munkatársai fizikai és kémiai tulajdonságait és reakciókinetikáját.(1989) egy bázikus PLA2-t (VRVPL-V) izoláltak a vipera mérgéből.A PLA2 monomer molekulatömege 10000, aminek halálos, véralvadásgátló és ödémás hatása van.Az enzim különböző molekulatömegű polimereket tud polimerizálni PH 4,8 körülmény között, és a polimerizáció foka és molekulatömege a hőmérséklet emelkedésével növekszik.A 96 °C-on keletkező polimer molekulatömege 53 100, és ennek a polimernek a PLA2 aktivitása kettővel nő.
Feladás időpontja: 2022.11.18